DNA的提取設(shè)備 離心機(jī) 電泳設(shè)備 凝膠成像系統(tǒng)
1 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
用酒精棉球?qū)?shí)驗(yàn)操作臺(tái)進(jìn)行擦拭即可.
2 菌體收集
用1.5mlEP管對(duì)過(guò)夜培養(yǎng)的大腸桿菌進(jìn)行菌體收集，收集兩次約2.5ml過(guò)夜培養(yǎng)的菌液（有時(shí)根據(jù)菌液濃度適當(dāng)調(diào)整）；取過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，加入離心管中，使用常規(guī)臺(tái)式離心機(jī)，12,000 rpm離心1 分鐘，后倒掉上清，進(jìn)行第二次收集，重復(fù)第一次實(shí)驗(yàn)操作；
3 菌體重懸
向留有菌體沉淀的離心管中加入250 μl 溶液P1（請(qǐng)先檢查是否已加入RNaseA），使用200ul移液槍徹底懸浮細(xì)菌沉淀。注意：如果有未徹底混勻的菌塊，會(huì)影響裂解，導(dǎo)致提取量和純度偏低。
4 菌體裂解
向離心管中加入250 μl 溶液P2，及時(shí)溫和地上下翻轉(zhuǎn)3-4次使菌體充分裂解，要及時(shí)，是防止局部裂解。注意：溫和地混合，不要?jiǎng)×艺鹗?，以免打斷基因組DNA，造成提取的質(zhì)粒中混有基因組DNA 片斷。此時(shí)菌液應(yīng)變得清亮粘稠，所用時(shí)間不應(yīng)超過(guò)5 分鐘，以免質(zhì)粒受到破壞。如果未變得清亮，可能由于菌體過(guò)多，裂解不徹底，應(yīng)減少菌體量。
5 中和反應(yīng)
向離心管中加入350 μl 溶液P3（主要是些NacooH，中和溶液2中的堿），立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)3-4 次，充分混勻，此時(shí)將出現(xiàn)白色絮狀沉淀。注意：P3 加入后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。
6 柱子平衡
拿出吸附柱和收集管，將吸附柱套入入收集管中，向吸附柱CP3 中加入500μl 的平衡液BL，12,000 rpm (~13,400×g ) 離心1 分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。（請(qǐng)使用當(dāng)天處理過(guò)的柱子）
7 離心去除沉淀
將第五步驟中和反應(yīng)后的溶液，用12,000 rpm (~13,400×g )離心15 分鐘去除菌體裂解后的殘留蛋白和基因組DNA，時(shí)其在離心管底部形成沉淀，質(zhì)粒分布于上清液。
8 質(zhì)粒過(guò)柱純化
將上一步收集的上清液轉(zhuǎn)移到吸附柱CP3 中 （吸附柱放入收集管中），注意盡量不要轉(zhuǎn)移出沉淀。12,000 rpm (~13,400×g)離心30-60 秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3 放入收集管中。
9 漂洗
向吸附柱CP3 中加入600 μl 漂洗液PW（檢查是否已加入無(wú)水乙醇），12,000 rpm (~13,400×g )離心30-60 秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。（一般漂洗兩次）。
10 空甩
一般在漂洗后要進(jìn)行一次的空甩，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，具體是12,000 rpm (~13,400×g) 空甩離心2 分鐘，后置于室溫放置數(shù)分鐘。
11 洗脫DNA
取干凈的離心管，將吸附柱CP3 置于干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位滴加50μl事先溫浴的洗脫緩沖液，室溫放置2 分鐘，12,000 rpm (~13,400×g) 離心1 分鐘將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。
12 瓊脂糖電泳檢測(cè)提取質(zhì)粒質(zhì)量
事先配制好1%濃度的瓊脂糖電泳凝膠。取3ul上步驟提取的質(zhì)粒，點(diǎn)樣，200V電壓 電泳15min，后于成像系統(tǒng)觀察。
掃我聯(lián)系