一）簡介：
用簡易的差分離心結(jié)合各種型式的密度梯度離心可以分離和純化各種亞細(xì)胞器。研究者也可以根據(jù)自己的設(shè)備情況對實驗 參數(shù)作一定的改動，也可以更多地利用速率--區(qū)帶密度梯度離心或等密度離心來簡化實驗過程和提高分離純度。
二）實驗：
勻漿制備：
鼠肝12克加入0.25M蔗糖與5mM Tris-HCL (PH7.4)共45ml用"概論"中建議的勻漿設(shè)備與方法制備成勻漿待用。
鼠肝勻漿的差分分離程序
該實驗流程中
沉Ⅰ：細(xì)胞核、質(zhì)膜大片斷，重線粒體，少量未破碎細(xì)胞及極少量沉Ⅱ→沉Ⅳ的成份
沉Ⅱ：重線粒體、質(zhì)膜片斷，及少量沉Ⅲ→沉Ⅳ成份。
沉Ⅲ：線粒體、溶酶體，高爾基膜，部分粗內(nèi)質(zhì)綱及極少量沉Ⅳ成份
沉Ⅳ：所有的細(xì)膜質(zhì)可溶部份。
離心Ⅰ：低速冷凍離心機，50ml管。離Ⅱ，離Ⅲ為高速冷凍離心機8×50ml角轉(zhuǎn)頭。
離Ⅳ為超速機或高速機8×50ml角轉(zhuǎn)頭。
ii)從沉Ⅱ中純化線粒體：
勻漿保持在200mM甘露醇，50mM蔗糖，1mM EDTA, 10mM Hepes-Naoh (PH7.4)中，全部操作均應(yīng)使勻漿在冰溶中，產(chǎn)生沉Ⅱ后去除上清表面以及離心管壁部的脂肪（這一點很重要）
加20ml保持液到沉Ⅱ中稀釋到30ml，3000g×10分再次離心并重復(fù)以上過程二次以上，最后的沉淀保持在10ML保持液中。
iii)從沉Ⅳ中部份純化光滑微粒體：
保持液為0.25M蔗糖，5mM Tris-Hcl (PH7.4)沉淀中光滑微粒體成松軟狀態(tài)位于緊密狀態(tài)的粗糙微粒體沉淀之上。
小心地倒掉上清Ⅳ后，在沉Ⅳ中加入2~3ml保持液，輕搖，大部份光滑微粒體（沉ⅣA）將分散到清液中，而沉Ⅳ（B）（粗糙微粒體，緊密沉淀）仍在沉降中，倒出沉Ⅳ（A），余下的沉Ⅳ B加入2~3ml保持液即完成。
iii)從沉Ⅰ中部份純化質(zhì)膜：
保持液用 1mM NaHCO3
鼠肝加25ml保持液在研缽中鍾擊15次，仍用1mMNaCHO3稀釋在100ml，攪拌2分鐘并用孔徑力75μm的尼龍布過濾。然后離心得到Ⅰ加5ml 1mM NaHCO3到沉Ⅰ中再放入勻漿器，慢速往復(fù)2~3次。再用1mM NaHCO3稀釋到15ml，用水平轉(zhuǎn)頭10ml玻璃錐形管，1200g離心10分鐘，不用制動減速到停車，沉淀很明顯由三層組成。輕輕搖動或攪動即可使最上層的線粒體溶入上清液。中間層富含質(zhì)膜，最下層是細(xì)胞核。倒去上清加5ml1mM NaHCO3輕搖使中間層進(jìn)入溶液，注意要盡可能少地擾動最下層核沉淀。將再次倒出的上清液稀釋到15ml并重復(fù)以上離心過程即可進(jìn)一步純化質(zhì)膜。
iv)從上Ⅲ中分離粗糙和光滑微粒體：
從已經(jīng)去掉線粒體的上Ⅲ中可以比從沉Ⅳ中更有效地分離粗糙及光滑微粒體，配置溶液
0.6M蔗糖，5mM Tris-HCL, (PH8.0)
15mM CSCL, 1.3M蔗糖，0.25M蔗糖
用角式轉(zhuǎn)頭，10~13ml厚壁PC（聚碳酸脂）離心管，先注入3ml 1.3M蔗糖-5mM Tris-HCL再注入1.5ml 0.6M蔗糖-5mM Tris-HCL從而形成了一個在離心管下部的階梯形密度梯度。在梯度上部注入上Ⅲ直至充滿離心管。100000g×90分鐘。離心后得到二個主要部份：在0.6M蔗糖界面處或稍下一點是光滑微粒體，沉淀是粗糙微粒體。
要針筒吸出光滑微粒體。沉淀用三倍空積的5mM Tris-HCL(PH8.0)稀釋后再次離心160000g×30分，得到粗糙微粒體沉淀，再用2-3ml的0.25M蔗糖與5mM Tris-HCL(PH8.0)稀釋即可。
V）從勻漿中純化細(xì)胞核：
配制溶液：0.25M蔗糖在TKM（0.05M Tris-HCL,PH7.5）中及2.3M蔗糖在TKM中，25mM KCL, 5mM Mgcl2
將鼠肝放在研缽中加0.25M蔗糖-TKM，沖研10~15二次，用紗布過濾后加入二倍容積的2.3M-TKM，這樣就使蔗糖的濃度為1.62M（該濃度最好用光折射儀檢測確認(rèn)，20℃時折射率約為1.4115, 5℃時，1.4137）。
將此溶液9ml注入PC離心管，在溶液下屬注入3~4ml 2.3M蔗糖-TKM。 130000g×30分，5℃，甩平轉(zhuǎn)頭。
離心后倒去上清液即為核沉淀。它可以根據(jù)研究者需要用合適的緩沖劑稀釋。
vi)從沉Ⅰ中純化細(xì)胞核：
取沉Ⅰ，用旋渦混合器分散沉淀并加入等睇容積的60%（W/W）蔗糖--TKM，放入勻漿器上下抽動2~3次，繼續(xù)加入60%（W/W）蔗糖-TKM直至蔗糖濃度達(dá)到56%（W/W），用折射儀檢測（5℃折射率1.4356，20℃時，1.4328）。取該溶液9ml移入14ml聚碳酸脂（PC）離心管管下部鋪3~4ml60%(W/W)蔗糖液，在甩平轉(zhuǎn)頭中120000g 5℃離心30分鐘，倒去上清液。余下的核沉淀可用合適的緩沖液稀釋。為了消除沉淀中的膜，在制備勻漿時可用0.5% Triton x-100清洗。這種做法既消除了膜，又不影響核的結(jié)構(gòu)。
vii)從沉Ⅰ中純化質(zhì)膜
配制溶液：60%（W/W）蔗糖液，37.2%(w/w)蔗糖液均分別加在5mM Tris-HCL(PH8.0)中將已制備好的沉Ⅰ乘余的緩沖液一起用溫旋混合器混合后再加入60%（W/W）蔗糖使蔗糖終濃度為48%，并用折射儀檢測（5℃，1.4181; 20℃, 1.4158）。取以上溶液6ml注入14ml PC離心管，上鋪6ml 37.2%w/w蔗糖液以1m PH7.4緩沖液。在甩平轉(zhuǎn)頭中160000g, 5℃,離心3小時。
質(zhì)膜聚集在37.2%w/w蔗糖液的上部，用注射器吸出，并用三倍容積的5mM Tris-HCL(PH8.0)稀釋后再在100000g, 5℃離心40分鐘，沉淀即為質(zhì)膜。
viii)從沉淀Ⅰ中純化重體粒體
配制溶液：0.25M蔗糖，10mM Hepes-NaOH(PH7.5), 1mM EDTA, 1mM Mgcl2,2.4M蔗糖，將沉Ⅰ用0.25M蔗糖，10mM Hepes-Naoh (PH7.5)，1mM Mgcl2稀釋到15ml。要盡可能避免動及沉淀最底部的紅色部份。將已稀釋部份倒出，混勻后加入23ml 2.4M蔗糖，10mMHepes-Na(OH)(PH7.5),1mM Mgcl2。所得到的最終蔗糖濃度力1.0M 。
用光折射儀測定（5℃，1.3827;20℃,1.3812）如需要，進(jìn)行調(diào)節(jié)，將此液體倒入一個50ml PC管，上鋪8ml 0.25M蔗糖，10mM Hepes-Naoh(PH7.5)在35000g, 5℃離心10分鐘，倒去上清液重擦凈沾在離心管壁上的物質(zhì)。沉淀很清楚有二層，須離心管內(nèi)壁加入10ml 0.25M蔗糖10mM Hepes-Naoh (PH7.5), 1mM EDTA，輕輕晃動并稀釋沉淀的上部褐色重線粒體層。
對于其他組織材料的線粒體純化問題，請參照"Methods in Enzymology)第55卷。
?、某立笾屑兓苊阁w及粒體：
配制溶液：0.3M,1.1M,2.1M蔗糖分別溶入1mM EDTA與5mM Tris-HCL (PH7.0)在14mlPC管中制備好二個10ml，1.1M,2.1M蔗糖的線性梯度可以用梯度形成儀做成，也可以用不連續(xù)梯度(1.1M,1.4M,1.7M,2.1M，每種2.5ml)在5℃靜量12~16小時也會形成連續(xù)的1.1~2.1M近線性梯度。
在沉Ⅲ中加入10ml,0.3M蔗糖液，輕搖，慢慢地可以看到離心管底部沉積了暗褐色的沉淀（溶酶體）倒去上清，加入4ml 0.3M蔗糖液在勻漿器中磨勻（注意：活塞與器壁要松一些）。取2ml以上勻漿置于線性梯度(1.1M~2.1M蔗糖)之上，輕攪勻漿使其與梯度液之間的界面盡可能減少密度的不連續(xù)，在甩平轉(zhuǎn)頭中95000g,5℃孫心4小時。
離心后，溶酶體區(qū)帶形成于1.20~1.26 g/cm3密度之間（在離心管下部）而線粒體則形成于1.17~1.21g/cm3密度之間（在離心管中部。溶酶體區(qū)帶中密度較高的部份相對較純。
用光折射儀測定（5℃，1.3827;20℃ 1.3812）如需要進(jìn)行調(diào)節(jié)，將此液體例入一個50ml PC管，上鋪8ml 0.25M蔗糖，10mM Hepes-NaOH(PH7.5)在35000g,5℃離心10分鐘，倒去上清液重擦凈沾在離心管壁上的物質(zhì)。沉淀很清楚有二層，順離心管內(nèi)壁加入10ml 0.25M蔗糖10mM Hepes-NaOH (PH7.5) 1mM EDTA，輕輕晃動并稀釋沉淀的上部褐色重線粒體層。
對于其他組織材料的線粒體純化問題，請參照"Methods in Enzymology)第55卷。
Ⅸ）從沉Ⅲ中純化溶酶體及線粒體：
配制溶液：0.3M,1.1M,2.1M蔗糖分別溶入1Mm edta與5mM Tris-HCL(PH7.0)
在14ml PC管中制備好二個10ml, 1.1M,2.1M蔗糖的線性梯度可以用梯度形成儀做成，也可以用不連續(xù)梯度(1.1M,1.4M,1.7M,2.1M,每種2.5ml)在5℃靜置12~16小時也會形成連續(xù)的1.1~2.1M近線性梯度。
在沉Ⅲ中加入10ml,0.3M蔗糖液，輕搖，慢慢地可以看到離心管底部沉積了暗褐色的沉淀（溶酶體）倒去上清，加入4ml 0.3M蔗糖液在勻漿器中磨勻（注意：活塞與器壁要松一些）。取2ml以上勻漿置于線性梯度(1.1M~2.1M蔗糖)之上，輕攪勻漿使其與梯度液之間的界面盡可能減少密度的不連續(xù)，在甩平轉(zhuǎn)頭中95000g,5℃離心4小時。
離心后，溶酶體區(qū)帶形成于1.20~1.26 g/cm3密度之間（在離心管下部）而線粒體則形成于1.17~1.21g/cm3密度之間（在離心管中部。溶酶體區(qū)帶中密度較高的部份相對較純。
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配置梯度溶液：38.79,36%,33%,29%(w/w)蔗糖液每種均加入5mM Tris-HCL(PH8.0)
用上清Ⅰ離心，10000g,5℃ 20分鐘待到沉Ⅱ+沉Ⅲ
用5ml 0.25M蔗糖，5mM Tris-HCL(PH8.0)稀釋沉淀，恒濕攪拌并使溶液的蔗糖濃度上升到43.07%(w/w)，用光折射儀檢測（5℃，1.1979;20℃,1.1957）
在PC離心管中(13ml)由下往上依次鋪設(shè)如下層次：
3ml樣品（蔗糖濃度43%w/w）,4ml 38.7%蔗糖液，2ml 36%蔗糖液，2ml 37%蔗糖液，2ml,29%蔗糖液。在甩平轉(zhuǎn)頭中160000g,5℃離心1小時，用注射器收集含有高爾基膜的上部二個區(qū)帶。
我們也可以用這個方法從全勻漿中來分離純化高爾基膜，勻漿中蔗糖濃度配到43.7%,然后用以上不連續(xù)梯度來分離純化，但是大于大容量勻漿，直接法是不合適的。
小結(jié)：以上典型實驗(1)鼠肝勻漿為原料，以差分離心為主，輔以蔗糖的連續(xù)或不連續(xù)梯度分離各種亞細(xì)胞器，方法簡單易行，或本也較低。我們也可以用Ficoll,percoll, Metrizamide,Nycodenz,……等等梯度材料來分離純化亞細(xì)胞器。
掃我聯(lián)系