1)取組織,加入10ml Buffer A 于冰上充分勻漿。
2)J6-HC離心機(jī)800rpm,4℃離心10min后,所得上清液轉(zhuǎn)入超速離心管。
3)100000g,4℃離心1hr。棄去上清,沉淀用適量的 Buffer B重懸,冰上孵育2hr后分裝至EP管,臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)10000rpm,4℃離心30min。
4)收集所得上清液即為膜組份。
Buffer A:0.32M 蔗糖,5mM Tris-HCl(PH 7.5),120mM KCl,1mM EDTA,1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上預(yù)冷。
Buffer B:20mM HEPES(PH 7.5),10%甘油,2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。 冰上預(yù)冷。