非玻璃化凍存方法
下面以腫瘤細胞和雜交瘤細胞為例，介紹非玻璃化凍存細胞的詳細過程。
主要材料
（1）儀器設備：普通冰箱、-300C低溫冰箱和-700C～-800C超低溫冰箱、液氮凍存罐、高速離心機、電子計算機程控降溫儀等；
（2）凍存管：容量為1ml或1.5ml；
（3）冷凍保護液：一般是以9份小牛血清或細胞培養(yǎng)液與1份DMSO混合而成。現(xiàn)配現(xiàn)用，或配制后防入普通冰箱冰盒內(nèi)冷凍保存。使用前，于室溫下水浴溶解；
（4）待凍存細胞：各種腫瘤細胞或雜交瘤細胞。
操作過程
1. 待凍存細胞懸液的制備
(1) 按常規(guī)方法消化處于對數(shù)生長期的細胞培養(yǎng)物，制備單細胞懸液，并計算細胞總數(shù)
；
(2) 將細胞懸液以800～1000r/min離心5min，去上清夜；
(3) 向細胞沉淀物中加入冷凍保護液，輕輕吹打混勻，使細胞密度達1×106～1×107個
/ml；
(4) 按每管1～1.5ml的量分裝于凍存管內(nèi)，擰緊管蓋；
(5) 再凍存管上做好標記，包括細胞代號及凍存日期。
2. 分級冷凍
(1) 先將凍存管放入普通冰箱冷藏室（4～80C），約40min；
(2) 接著將凍存管置于普通冰箱冷凍室（-100C～-200C），約30～60min；
(3) 將凍存管轉(zhuǎn)入低溫冰箱（-300C），放置30min左右；
(4) 然后將凍存管轉(zhuǎn)移到超低溫冰箱（-700C～-800C），過夜；
(5) 最后將凍存管投入液氮保存。
3. 記錄
做好凍存記錄。記錄內(nèi)容包括凍存日期、細胞代號、凍存管數(shù)、凍存過程中降溫的情況、凍存位置以及操作人員。
凍存結(jié)果
如此凍存的細胞，其存活率可達90%以上。
討論
在使用DMSO前，不要對其進行高壓滅菌，因其本身就有滅菌作用。高壓滅菌反而會破壞其分子結(jié)構(gòu)，以致降低冷凍保護效果。在常溫下，DMSO對人體有毒，故在配制時最好帶手套。
在將細胞凍存管投入液氮時，動作要小心、輕巧，以免液氮從液氮罐內(nèi)濺出。若液氮濺出，可能對皮膚造成凍傷。操作過程中最好帶防凍手套、面罩、工作衣或防凍鞋。
應注意控制凍存細胞的質(zhì)量。既要在凍存前保障細胞具有高活力，還要確保無微生物污染，這樣的細胞才具有凍存價值。另外，在每批細胞凍存一段時間后，要復蘇1～2管，以觀察其活力以及是否受到微生物的污染。
凍存管宜采用塑料凍存管，不宜使用玻璃安瓿。因為在復蘇時，需要從-1960C的液氮中取出
凍存管，立即投入37～400C溫水中，溫差很大，玻璃安瓿瓶容易爆炸而發(fā)生危險。
掃我聯(lián)系